諾如病毒(Norovirus),又稱為膿融病毒,是一種引起非細菌性急性胃腸炎的病毒。可略寫為NV。感染諾如病毒后常見的癥狀是腹瀉、嘔吐、惡心,或伴有發熱、頭痛等癥狀。兒童患者嘔吐、惡心多見,成人患者以腹瀉為多,嘔吐少見。病程一般為2-3天,此病是一種自限性疾病,恢復后無后遺癥。實驗室檢查
電鏡法
直接電鏡法(EM)和免疫電鏡法(IEM),EM 法觀察的靈敏度較低,要求每毫升糞便樣品中至少有大約 106個病毒粒子,因此只能用于患病早期病毒大量排出時采集的樣本檢測。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍,主要應用患者恢復期血清捕捉同型抗原,從而增加檢出率。電鏡法的缺陷在于設備昂貴,不能廣泛普及;檢測結果與操作者的技能和經驗有直接關系;靈敏度相對較低;不適于大規模流行病學調查。
免疫法
包括放射免疫法(RIA)、生物素-親和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶聯免疫法(ELISA)。RIA法的靈敏度比IEM 法可 提高10~100倍,可以檢測出抗體升高的水平,為流行病學提供更有參考價值的資料。RIA 法的不足之處在于它需要 6 d,且需要放射性同位素標記。為了簡化方法,美國疾病預防控制中心建立了生物素-親和素免疫法,其靈敏度與 RIA 法相當,目前該方法已成為美國疾病預防控制中心檢測NLV抗原和抗體的標準實驗方法之一。
重組桿狀病毒表達諾如病毒(NV)衣殼蛋白成功后,建立起的 NV 酶聯免疫檢測方法快速、靈敏、經濟,其不足之處是免疫反應的株型特異性太強,所以應用范圍還比較窄。酶鏈免疫法特異性強,靈敏度高,診斷迅速,且較經濟,是目前可廣泛應用的檢測方法。
分子生物學檢測方法
雜交技術和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)除了能更準確、靈敏地檢測標本中的NV,尤其是低濃度的NV感染外,大的優點在于可以進一步對病毒進行基因型的研究,不會受到獲得分型單克隆抗體的限制,對流行病學研究具有重要意義。
等溫核酸擴增法 (NASBA)直接擴增RNA 來檢測 NV,樣品中病原RNA得到指數級擴增,產物通過瓊脂糖凝膠電泳或斑點印跡雜交鑒定結果。該方法的靈敏度略低于 RT-PCR 法;整個過程只有一步RNA擴增,避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染;縮短了操作時間;假陽性率低。
食物中NV的檢測
RT-PCR檢測食物中NV存在樣品病毒量含量低,樣品量大且成分復雜等問題,因此病毒富集濃縮、樣品處理是檢測的關鍵,其中有兩個重要方面影響檢測結果,一是樣品中病毒濃縮后的回收率,二是抽提核酸的完整程度和純度。 檢驗地帶網
病毒濃縮
病毒濃縮 NV 濃縮方法一般分為兩大類,一類為有機絮凝沉淀法,主要使用聚乙二醇(PEG)沉淀,PEG 是具有強烈吸水性以及凝聚和沉淀蛋白作用的高分子聚合物,先改變樣品 pH 值,使毒粒與樣品微粒分開,PEG 把病毒沉淀下來,達到濃縮的目的。目前對于固體樣品 PEG 沉淀法是有效的濃縮方法。 www.labdd.com
膜過濾法是另一類有效濃縮病毒的方法,通過改變膜的pH值使之與帶有電荷的毒粒結合捕捉病毒,這種方法通常用在濃縮大體積的黏度小、內容顆粒小的液體食品或水中。檢測海水、生活污水中的NV曾用過這種方法,為瓶裝水和其他飲料濃縮NV提供了參考。
核酸提取
食品樣品成分復雜,所含有的脂肪、蛋白質、金屬離子等物質都是 RT-PCR 反應抑制因子。NV是單鏈RNA病毒,核酸提取方法的優劣取決于兩個方面:核酸的質量和去除抑制因子的能力。
目前應用較成熟廣泛的是胍法 RNA 提取法,即(異)硫氰酸胍-苯酚-氯仿聯合裂解抽提法,該方法改進后制成市售的TRIzol、RNAzol、Ultraspec 等產品,與石英砂、磁珠等多孔顆粒相結合,已結合了poly(dT) 或特異探針的磁珠能較高程度的提純mRNA,去除反應抑制因子。石英砂或磁珠純化 RNA與傳統的有機試劑(異丙醇、乙醇)沉淀 RNA 相比起來,效果較好,只是成本偏高。